본 발명은 글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하면, 정제과정에서 비용 상승을 초래하는 부산물의 생성 없이, 향상된 수율로 1, 3-프로판디올을 생산할 수 있다.