본 발명은 글리세롤로 또는 폐글리세롤을 탄소원으로하여 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 글리세롤 발효성 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소된 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.본 발명은 미생물에 감마선을 조사하여 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하여 에탄올을 고효율로 생산하는 변이 미생물을 제공하는 효과가 있으며, 본 발명에 따른 변이 미생물은 글리세롤 환원 대사경로의 대사산물의 생산이 거의 없을 뿐만 아니라, 바이오디젤 산업의 부산물인 폐글리세롤을 이용하여 고부가가치 산물인 에탄올을 고효율로 생산하여 산업적으로 유용하다.